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Cromatografia su colonna e caratterizzazione fluorimetrica

Cromatografia su colonna e caratterizzazione fluorimetrica

Scopo: purificare e caratterizzare una soluzione di proteina (BSA) marcata con un colorante fluorescente

Cenni teorici: per purificare la proteina ci siamo serviti della tecnica della cromatografia per esclusione, un processo di analisi che separa le sostanze organiche in base al loro peso molecolare. Si distinguono due fasi: una  "fase stazionaria", un supporto solido con pori di dimensioni definite, e una  "fase mobile", un solvente organico o acquoso che eluisce i soluti attraverso la colonna cromatografica.


Le sostanze che hanno un peso molecolare molto elevato usciranno dalla colonna per prime poiché, avendo un volume maggiore, non rimarranno intrappolate nei pori della fase stazionaria. Quelle con peso minore, invece, impiegheranno un tempo maggiore per fluire attraverso la colonna perché, essendo più piccole, saranno trattenute in essa dai pori della fase stazionaria. 


Per marcare la nostra BSA abbiamo utilizzato delle molecole di FITC, un fluorocromo noto con il nome di isotiocianato di fluoresceina che si lega covalentemente ai gruppi amminici primari delle proteine.


Procedimento: per svolgere l’esperienza abbiamo prima di tutto dovuto allestire la nostra colonna cromatografica; abbiamo preparato una soluzione al 75 % di resina e, utilizzando una pipetta serologica, abbiamo trasferito quest’ultima all’interno della colonna. Per mantenere la colonna idratata e con una forza ionica e pH caratteristici abbiamo fatto un ciclo di lavaggio con HEPES, NaCl e carbonato facendo attenzione a non generare bolle. Dopo aver eliminato il tampone in eccesso, abbiamo inserito 1ml del nostro campione, Albumina-FITC (0,1mM), cercando di proteggerlo dalla luce per non alterare le proprietà fotosensibili del fluoroforo;  abbiamo aspettato che si verificasse la separazione tra la proteina marcata (che scende in fretta) e la FITC non legata (che si ferma in cima), abbiamo lavato con tampone carbonato e abbiamo raccolto l’eluato in una provetta graduata. La colonna è stata poi lavata con carbonato, NaCl e Triton-X.
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