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Il pittore toscano ha scelto di rappresentare non il primo momento dell'incontro tra Gesù e la Samaritana, insistendo sulla sorpresa di quest'ultima, ma la fase successiva dell'approfondimento teologico
La donna si appoggia sul bordo del pozzo e, riconosciuto in Cristo il Profeta, lo interroga sulla delicata questione che aveva causato lo scisma tra Samaritani e Giudei:
Qual è il Tempio di Israele, quello costruito dai Samaritani sul Garizim o il tempio di Gerusalemme? La risposta di Gesù rimanda al mutamento radicale dei rapporti dell'uomo con Dio: questi non sarà più adorato in un tempio di pietra, in un luogo materiale seppur altamente simbolico, ma in spirito e verità.
Gesù nell'illustrare i suoi argomenti alla Samaritana si tocca il pollice della mano sinistra con l'indice e il pollice della destra, utilizzando il compito digitale, motivo iconografico molto diffuso per semplificare le dispute teologiche o filosofiche
